分光光度計(jì)已成為現(xiàn)代分子有機(jī)體實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用用于定量核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)菌生長(zhǎng)濃度。分光光度計(jì)的簡(jiǎn)單原理 分光光度計(jì)使用能夠產(chǎn)生多種波長(zhǎng)的光源，并通過一系列分光裝置來產(chǎn)生具有特定波長(zhǎng)的光源。光源通過被測(cè)樣品后，部分光源被吸收，并計(jì)算樣品的光吸收值，從而將光吸收值轉(zhuǎn)化為樣品的濃度。樣品的吸光度與樣品的濃度成正比。 核酸的定量 核酸的定量是分光光度計(jì)高頻z大值的函數(shù)。寡核苷酸、單鏈和雙鏈脫氧核糖核酸以及可定量溶解在緩沖溶液中的核糖核酸。核酸的zui高吸收峰的吸收波長(zhǎng)為260納米。每種核酸的分子組成不同，因此其轉(zhuǎn)化系數(shù)也不同。為了量化不同類型的核酸，應(yīng)事先選擇相應(yīng)的系數(shù)。例如，10d的吸光度分別相當(dāng)于50微克/毫升dsDNA、37微克/毫升ssDNA、40微克/毫升核糖核酸和30微克/毫升寡核苷酸。通過上述系數(shù)轉(zhuǎn)換測(cè)試后的吸光度值，以獲得相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入儲(chǔ)備溶液和稀釋劑的體積，然后測(cè)試空白溶液和樣品溶液。然而，實(shí)驗(yàn)并不是一帆風(fēng)順的。不穩(wěn)定的讀數(shù)可能會(huì)讓醉頭疼。儀器的靈敏度越高，吸光度漂移越大。 事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理允許吸光度值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器具有一定的準(zhǔn)確度和程度。例如，e1pp恩多夫生物光度計(jì)的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這種測(cè)試的結(jié)果在平均值的大約1.0%之間變化是正常的。此外，核酸本身的物理化學(xué)性質(zhì)、溶解核酸的緩沖溶液的酸堿度、離子濃度等。還應(yīng)考慮:過高的離子濃度會(huì)導(dǎo)致測(cè)試期間讀數(shù)漂移。因此，推薦使用具有一定酸堿度和低離子濃度的緩沖溶液，如TE，以大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度也是一個(gè)不可忽視的因素:因?yàn)闃悠分胁豢杀苊獾卮嬖谝恍┪⒘?，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在會(huì)干擾測(cè)試結(jié)果。為了使zui大大減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸的吸光度值至少大于0.1A，并且吸光度值z(mì)ui優(yōu)選為0.1-1。在此范圍內(nèi)，粒子的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。這意味著樣品的濃度不能過低或過高(超出光度計(jì)的測(cè)試范圍)。后醉是經(jīng)營因素。如果混合足夠，則光吸收值太低，甚至為負(fù)值。混合液中不存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移嚴(yán)重；必須使用同一試管來測(cè)試空白溶液和樣品，否則濃度差太大；轉(zhuǎn)換系數(shù)與樣品濃度單位相同。不能使用窗戶磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色皿和其他操作項(xiàng)目所需的z小體積。除了核酸濃度之外，分光光度計(jì)同時(shí)顯示了幾個(gè)非常重要的指示樣品純度的比率，例如A260/A280比率，其用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的吸收峰是280納米。純樣品的比例大于1.8(脫氧核糖核酸)或2.0(核糖核酸)。如果該比率低于1.8或2.0，則表明存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)。A230表示樣品中有一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等。更純的核酸A260/A230的比率大于2.0。A320檢測(cè)溶液的濁度和其他干擾因素。純樣品，A320一般為0。 蛋白質(zhì)的直接定量(紫外法) 該方法直接在280納米波長(zhǎng)下檢測(cè)蛋白質(zhì)。如果選擇沃伯格公式(Warburg formula)，光度計(jì)可以直接顯示樣品的濃度，或者選擇相應(yīng)的轉(zhuǎn)換方法將吸光度值轉(zhuǎn)換成樣品的濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定的加工非常簡(jiǎn)單。 先測(cè)試空白溶液， 蛋白質(zhì)通常是各種蛋白質(zhì)的化合物。比色法測(cè)定基于蛋白質(zhì)成分:氨基酸(如酪氨酸和絲氨酸)與其他發(fā)色基團(tuán)或染料反應(yīng)生成有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)與之反應(yīng)的氨基酸數(shù)量直接相關(guān)，因此反映了蛋白質(zhì)的濃度。比色法通常包括BCA法、布拉德福德法、勞里法和其他方法。 Lowry方法:基于zui的早期縮二脲反應(yīng)并加以改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2反應(yīng)生成藍(lán)色反應(yīng)物。然而，與縮二脲相比，洛瑞法更靈敏。缺點(diǎn)是需要依次加入幾個(gè)不同的反應(yīng)試劑。這種反應(yīng)需要很長(zhǎng)時(shí)間。易受非蛋白質(zhì)物質(zhì)影響；含有乙二胺四乙酸、Triton x-100、硫酸銨和其他物質(zhì)的蛋白質(zhì)不適合這種方法。 BCA(雙蘇氨酸測(cè)定)方法:這是一種相對(duì)較新且更靈敏的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。蛋白質(zhì)分析在堿性溶液中與Cu2反應(yīng)生成銅，銅與BCA形成螯合物，形成吸收峰在562納米波長(zhǎng)的紫色化合物。該化合物與蛋白質(zhì)濃度之間的線性關(guān)系非常強(qiáng)，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。與Lowry方法相比，該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。然而，與Lowry方法相似，它容易受到蛋白質(zhì)和洗滌劑的干擾。 布拉德福德法(Bradford method):該方法的原理是蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍(lán)結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生595nm的有色化合物吸收峰。其嘴的特點(diǎn)是靈敏度高，是勞瑞和BCA的兩倍。操作更簡(jiǎn)單、更快。只需要一個(gè)反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)以促進(jìn)結(jié)果。而且還受到BCA勞里的一系列干擾