普通的X-射線法（鉬靶）僅能構(gòu)筑化合物的相對構(gòu)型，不能區(qū)分對應(yīng)異構(gòu)體。如果分子中含有重原子（一般原子序數(shù)大于16）或在分子中引入一個重原子，就可用X-射線來測定該重原子的手性分子絕對構(gòu)型。此外，通過引入另一個已知絕對構(gòu)型的手性分子也可獲得結(jié)構(gòu)的絕對構(gòu)型。隨著技術(shù)的發(fā)展，采用CuKa作為入射光源的X-射線單晶CCD衍射儀，對于測定相對分子量在1000以下、含C、H、N、O原子有機分子的絕對構(gòu)型已可實現(xiàn)了。

在單晶結(jié)構(gòu)分析中，目前國際公認表征絕對構(gòu)型的參數(shù)稱為Flack 參數(shù)，當結(jié)構(gòu)分析進入到最后的精修階段時，如果該參數(shù)等于或接近0，或其參數(shù)在± 0.3之內(nèi)，那么一般認為絕對構(gòu)型就被確定了。

采用單晶X-衍射法樣品用量少、測定迅速、結(jié)果可靠直觀，可以作為最終的立體構(gòu)型的確定方法。但是由于測試的儀器價格昂貴，對單晶有嚴格要求，也限制了X-射線衍射法的應(yīng)用。